Reaksi asam galat dengan pereaksi Folin-Ciocalteu
Senyawa fenolik seringkali dikaitkan dengan aktivitas
antioksidan dalam suatu tanaman terutama akibat adanya gugus hidroksil pada
strukturnya. Gugus hidroksil berkontribusi sebagai penyumbang atom hidrogen
ketika bereaksi dengan senyawa radikal melalui transfer elektron sehingga dapat
mencegah reaksi oksidasi oleh senyawa radikal. Penetapan kandungan fenolik
total dapat dilakukan dengan metode Folin-Ciocalteu. Pemilihan metode
Folin-Ciocalteu karena metode ini sederhana, cepat dan murah namun memiliki
reliabilitas yang tinggi. Reagen Folin-Ciocalteu merupakan oksidator senyawa
fenolik didalam sampel untuk menghasilkan kompleks warna biru yang diukur
intensitasnya dengan spektrofotometer sinar tampak (Agustiningsih dkk., 2010).
Penetapan
kandungan fenolik dalam sampel digunakan asam galat sebagai senyawa fenol
pembanding (Gambar 11). Asam galat merupakan golongan asam fenolik C6-C1
atau hidroksibenzoat yang mudah diperoleh dalam kondisi stabil dan murni, serta
lebih murah dibandingkan dengan senyawa standar lainnya (Lestari dkk., 2015). Menurut Prior dkk. (2005), pemilihan standar penetapan
fenolik total disesuaikan dengan jenis senyawa fenolik di dalam sampel namun
asam galat merupakan standar yang direkomendasikan untuk mendapatkan hasil yang
reliabel. Asam galat diketahui memiliki reaktivitas yang cukup tinggi terhadap reagen Folin-Ciocalteu dibandingkan
dengan senyawa fenolik lainnya sehingga dapat digunakan sebagai standar dalam
penetapan kadar fenolik total (Everette dkk., 2010). Reagen Folin Ciocalteau digunakan karena senyawa fenolik dapat bereaksi dengan Folin-Ciocalteu membentuk larutan
berwarna yang dapat diukur
absorbansinya.
Prinsip
dari
metode Folin-Ciocalteu adalah terbentuknya senyawa kompleks berwarna biru yang dapat diukur pada panjang gelombang 765 nm. Pereaksi ini mengoksidasi fenolat (garam alkali) atau gugus fenolik-hidroksi mereduksi asam
heteropoli (fosfomolibdat-fosfotungstat) yang terdapat dalam pereaksi
Folin-Ciocalteu menjadi suatu kompleks molibdenum-tungsten. Ion fenolat dibentuk
melalui disosiasi proton senyawa fenolik, reaksi ini hanya dapat terjadi dalam
kondisi basa, sehingga pada penelitian ini digunakan natrium karbonat sebagai
basa. Gugus hidroksil pada
senyawa fenolik bereaksi dengan reagen Folin-Ciocalteu membentuk kompleks
molybdenum-tungsten berwarna biru yang dapat dideteksi dengan spektrofotometer
(Alfian dan Hari, 2012). Warna biru yang dihasilkan menggambarkan jumlah kompleks
yang terbentuk, sehingga semakin tinggi kandungan fenolik dalam suatu ekstrak,
semakin pekat warna biru yang dihasilkan (Apsari dan Susanti, 2011).
Prosedur Analisis:
1.
Pembuatan Larutan Folin
Ciocalteau 10%
Pembuatan larutan Folin Ciocalteau (FC) 10% (v/v)
dilakukan dengan cara larutan Folin
Ciocalteau 100% dipipet 10 mL kemudian dimasukkan kedalam labu takar 100
mL. Selanjutnya, larutan ditambahkan akuades hingga tanda tera dan
dikocok hingga homogen.
2.
Pembuatan Larutan Na2CO3 7,5%
Pembuatan larutan Na2CO3
7,5% (w/v) dilakukan dengan cara Na2CO3 ditimbang sebanyak 7,5 g dan
dimasukkan dalam gelas kimia 10 mL. Na2CO3 dilarutkan dengan sedikit
akuades kemudian larutan dimasukkan dalam labu takar 100 mL. Selanjutnya,
ditambahkan akuades hingga tanda tera dan dikocok hingga homogen.
3.
Pembuatan Larutan Standar Asam Galat
a.
Pembuatan
Larutan Asam Galat 1000 ppm
Pembuatan
larutan asam galat 1000 ppm dibuat dengan cara asam galat ditimbang sebanyak
0,5 g dan dimasukkan kedalam gelas kimia 10 mL. Selanjutnya, asam galat 0,5 g
diencerkan dengan sedikit akuades kemudian dimasukkan dalam labu takar 500 ml
dan ditambahkan akuades hingga
tanda tera dan larutan dikocok hingga homogen.
b.
Pembuatan
Larutan Asam Galat 100 ppm
Pembuatan larutan asam galat 100 ppm dibuat dengan cara asam
galat 1000 ppm dipipet sebanyak 50 mL. Selanjutnya, dimasukkan dalam labu takar
500 ml dan ditambahkan akuades hingga tanda
tera kemudian larutan dikocok hingga homogen.
c.
Pembuatan
Larutan Standar Asam Galat
Larutan standar asam
galat dibuat konsentrasi 5,10, 30, 50, 70, dan 90 ppm. Larutan standar
asam galat disiapkan dengan cara memipet larutan asam galat 100 ppm masing-masing
sebanyak 5, 10, 30, 50, 70 dan 90 mL selanjutnya dimasukkan masing-masing
kedalam labu takar 100 mL yang berbeda. kemudian ditambahkan masing-masing
akuades hingga tanda tera dan dikocok hingga homogen.
4.
Penentuan Operating
Time
Penentuan operating time digunakan larutan asam
galat 30 ppm. Larutan asam galat 30 ppm dipipet 3 mL dan dimasukkan dalam
tabung reaksi. Selanjutnya, larutan ditambahkan 15 mL reagen FC 10% kemudian dikocok hingga homogen dan
didiamkan selama 3 menit. Ke dalam
larutan ditambahkan 12 mL larutan Na2CO3 7,5% dan dikocok
hingga homogen. Larutan diukur absorbannya pada waktu 0-90 menit dalam rentang
5 menit dengan panjang gelombang 765 nm.
5.
Penentuan Panjang Gelombang Maksimum
Penentuan panjang gelombang maksimum ditentukan dengan menggunakan
spektrofotometer UV-Vis pada larutan asam galat 30 ppm. Larutan asam galat 30 ppm dipipet 3 mL dan dimasukkan
dalam tabung reaksi. Selanjutnya, larutan ditambahkan 15 mL reagen FC 10% dan dikocok hingga homogen dan
didiamkan selama 3 menit. Kemudian dalam
larutan ditambahkan 12 mL larutan Na2CO3 7,5% dan dikocok
hingga homogen. Larutan tersebut didiamkan pada operating time suhu
kamar, kemudian absorbannya diukur pada panjang gelombang 600-850 nm.
6.
Pengukuran Larutan Standar Asam Galat
Pengukuran larutan
standar asam galat dengan konsentrasi 5, 10, 30, 50, 70 dan 90 ppm. Larutan standar
asam galat konsentrasi 5, 10, 30, 50,
70 dan 90 ppm dipipet sebanyak 3 mL dan
masing-masing dimasukkan dalam tabung reaksi yang berbeda. Selanjutnya, larutan
standar asam galat ditambahkan masing-masing 15 mL reagen FC 10% kemudian
dikocok dan didiamkan selama 3 menit. Ke dalam larutan ditambahkan 12 mL
larutan Na2CO3 7,5% dan dikocok hingga homogen. Larutan
standar asam galat didiamkan pada suhu kamar dengan operating time dan
absorbannya diukur pada panjang gelombang maksimum. Kurva standar dibuat
hubungan antara konsentrasi asam galat dengan absorban.
7.
Penentuan Kandungan Fenolik Total
Pengukuran kandungan fenolik total pada
ekstrak hasil microwave dilakukan
dengan menggunakan pereaksi Folin-Ciocalteu mengikuti prosedur Das et al. (2012) dengan sedikit modifikasi.
Larutan standar yang digunakan adalah asam galat. Sampel ekstrak kulit kakao
hasil microwave dibuat dalam konsentrasi
10% v/v. Larutan ekstrak dipipet 1 mL menggunakan pipet volum kemudian
dimasukkan dalam labu takar 10 mL dan ditambahkan etanol p.a sampai tanda tera. Penentuan kadar fenolik
total dilakukan dengan cara larutan sampel dipipet sebanyak 3 mL dan masing-masing
dimasukkan dalam tabung reaksi yang berbeda. Selanjutnya, ekstrak ditambahkan
masing-masing 15 mL reagen FC 10% kemudian dikocok dan didiamkan selama 3
menit. Ke dalam larutan ditambahkan 12 mL larutan Na2CO3
7,5% dan dikocok hingga homogen. Larutan ekstrak didiamkan pada suhu kamar
dengan operating time. Absorban sampel diukur dengan spekrofotometer UV-Vis pada panjang gelombang absorban
maksimum. Konsentrasi fenolik diperoleh melalui kurva kalibrasi standar asam
galat (y = ax + b). Kandungan fenolik total ekstrask ditentukan melalui
persamaan, hasil pengukuran ini dinyatakan sebagai mg/g.
KFT = x
(v/w)
Keterangan:
x = konsentrasi awal (mg/L)
v = volume ekstrak (L)
w = berat sampel (g)
REFERENSI
Comments
Post a Comment